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Etude de l’activation du MPF et de la reprise de la méiose dans l’ovocyte.

proposé par Marika MIOT, Laboratoire de Biologie du Développement Sorbonne Université - Campus Pierre et Marie Curie 75005 Paris

Projet de stage : Chez le Xénope, au moment de l’ovulation, l’ovocyte bloqué en prophase reprend la méiose en réponse à la progestérone. Bien que largement incomprise, la voie de signalisation induite par la progestérone démarre par l’inhibition de l’activité de la protéine kinase, PKA, conduisant à la déphosphorylation de son substrat, la protéine Arpp19. Une fois déphosphorylée, Arpp19 lance une cascade de réactions qui aboutissent à l’activation du MPF. Le but de notre projet vise à élucider deux questions majeures concernant le mécanisme d’activation du MPF : (1) le rôle d’Arpp19 au cours de l’évolution : chez les Vertébrés, l’activation du MPF dépend d’une chute de l’activité de PKA. Au contraire, chez certains Invertébrés, la reprise de la méiose nécessite une activation de PKA. En tant que substrat de PKA, Arpp19 pourrait donc intégrer les effets paradoxaux de PKA sur la reprise de la méiose. Pour répondre à cette question, en collaboration avec deux équipes spécialisées dans la méiose chez la souris et un invertébré marin, la méduse Clytia, différentes formes mutées ou phosphorylées d’Arpp19 (de xénope, souris ou Clytia) seront injectées dans l’ovocyte de xénope et leurs effets sur l’activation du MPF seront analysés. (2) le double rôle d’Arpp19 dans la reprise de la méiose. En effet, bien que le mécanisme reste encore inconnu, Arpp19, phosphorylé par PKA, joue un rôle dans le maintien de l’ovocyte en prophase. Cependant, lors de l’induction par la progestérone, Arpp19 est phosphorylé sur un autre site par la kinase Greatwall, et cette phosphorylation est suffisante pour l’activation du MPF et la reprise de la méiose. Afin d’analyser l’interdépendance de ces 2 sites de phosphorylation, des formes tronquées d’Arpp19 contenant soit le site ciblé par PKA soit celui ciblé par Greatwall seront injectées et leurs effets sur la maturation méiotique seront étudiés. Ce projet se situe au carrefour de questions essentielles touchant à la fois la reproduction, le développement embryonnaire et la cancérogenèse.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : PCR, clonage, mutagenèse, expression et purification d’ARNm et protéines recombinantes, séparation ou analyse protéique par chromatographie, micro-injections dans l’ovocyte (ARNm, morpholinos, protéines recombinantes et inhibiteurs chimiques) et suivi de la reprise de la méiose et du profil d’activation du MPF dans les ovocytes micro-injectés et stimulés ou non par la progestérone, essais enzymatiques kinase et phosphatase in vitro, électrophorèse et western blots, immunoprécipitations et GST-pull down.

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