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Etude de la voie conduisant à l’activation du MPF (Cdc2 – cycline B) et la reprise de la méiose dans l’ovocyte

proposé par Anthi Karaiskou, Laboratoire Biologie du Développement, Equipe Biologie de l’ovocyte, UMR CNRS 7622, Université Pierre et Marie Curie, 9, quai St Bernard, 75005 Paris

Projet de stage : Dans l’ovocyte de Xénope arrêté en prophase de première division méiotique, le MPF est maintenu sous une forme de pré-MPF inactif, par deux phosphorylations inhibitrices de Cdc2, sur Thr14 et Tyr15. Les enzymes qui s’opposent et contrôlent le niveau de phosphorylation de ces résidus-clés sont identifiés : la phosphatase activatrice Cdc25 et la kinase inhibitrice Myt1. L’activation initiale du MPF repose donc sur la conversion du stock de pré-MPF inactif en MPF actif, suite à l’inhibition de Myt1 et/ou à l’activation de la phosphatase Cdc25. La régulation de ce deux acteurs dépend d’un système complexe de phosphorylations/déphosphorylations, association à des molécules adaptatrices et localisation cellulaire (revue Karaiskou et al., 2001). L’objectif du stage est d’étudier les mécanismes à l’origine de l’inhibition de Myt1 et à l’activation de Cdc25.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : Micro-injections (ARNm, morpholinos, protéines recombinantes et inhibiteurs chimiques) et suivie de la reprise de la méiose et du profil d’activation du MPF dans les ovocytes micro-injectés et stimulés ou non par la progestérone. Etude de l’activation du MPF in vitro, après simple addition de protéines recombinantes ou inhibiteurs chimiques, dans un système d’extraits, réalisable avec des ovocytes incompétents et compétents. Amplification de différents plasmides contenant de séquences d’intérêt. Mutagenèse dirigée (par PCR). Séquençage. Production des protéines recombinantes correspondantes par micro-injection des ARNm dans l’ovocyte ou par expression dans un système bactérien. Immunoblots, immuno-précipitations. Mesure d’activités enzymatiques (kinases, phosphatases).

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