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Etude des effets de l’activateur du plasminogène (t-PA) et des métalloprotéinases de la matrice sur les microvaisseaux cérébraux au cours du développement chez le souriceau ; Etude en culture cellulaire, analyse protéomique et transcriptomique

proposé par Dr Philippe Leroux, Laboratoire Néovasc, ERI-28 Université de Rouen,

Projet de stage :

Situation dans le contexte scientifique et médical au niveau national et international et son intérêt général, scientifique et médical On dénombre environ 800.000 naissances chaque année en France. 7 à 8% des naissances sont prématurées ou se passent dans un contexte délétère (infection maternelle, anoxie périnatale). Des lésions cérébrales néonatales touchent environ 1% des enfants soit 8000 nouveaux cas chaque année. Ces enfants montrent des handicaps tels que des paralysies cérébrales, des déficiences intellectuelles, des troubles des fonctions exécutives, du langage et/ou du comportement. Une étude récente évalue le coût moyen de prise en charge de ces patients à 850.000€ (Kruse et al., 2009). Les principales causes de déficits sont la prématurité (2 à 2,5 cas pour 1000 naissances), les infections materno-foetales, l’hypoxie pernatale, l’exposition à des toxiques. Plus de la moitié de ces handicaps ont une origine périnatale acquise entre 22 semaines d’aménorrhées (SA) et 8 jours de vie. La nature des lésions est variable selon le type du (des) facteur(s) impliqué(s) et dépend de l’âge de l’enfant lors de son exposition. Ceci résulte du stade de maturation cérébral qui continue d’évoluer plusieurs semaines après la naissance (Volpe, 2009). En particulier, les hémorragies intracrâniennes affectent essentiellement les prématurssimes (nés avant 28 semaines complètes d’aménorrhée). Il n’existe aucun biomarqeur de pronostique périnatal de ce risque hémorragique dès la naissance. De manière générale, il est très difficile d’établir un pronostique à long terme sur le développement cérébral, les conséquences motrices, cognitives et comportementales de l’enfant né prématuré, et/ou ayant été exposé à des conditions défavorables en période périnatale. L’interface neurovasculaire connait lui-même une maturation échelonnée sur le plan temporel et spatial dans cette période (Ballabh et al., 2004). Des études antérieures menées au laboratoire montrent que chez la souris l’endothélium microvasculaire est plus sensible à l’action du glutamate, le neurotransmetteur excitateur libéré lors de la plupart des stress tissulaires, et libère plus abondamment plusieurs protéases responsables de la dégradation de l’environnement matriciel extracellulaire que le tissu d’adulte (Legros et al., 2009, Henry et al., 2013). Par ailleurs, des travaux du laboratoire NéoVasc ont montré des anomalies de taux d’activateur du plasminogène (t-PA) et de son inhibiteur (PAI-1) chez les extrêmes prématurés (Sentilhes et al., 2011). Administré à l’adulte pour traiter une thrombose cérébrale, le t-PA est pro-hémorragique dans le territoire ischémié (Yepes et al., 2003). Cet effet résulte probablement de son action (ou de celle du complexe t-PA-PAI-1) via des récepteurs initiant des cascades de protéases entrainant une rupture vasculaire (Sashindranath et al., 2012). Dans plusieurs modèles de lésions cérébrales du souriceau une activité gélatinase, dépendante du t-PA est induite dans les microvaisseaux (Omouendze et al., en révision). Des études préliminaires réalisées au laboratoire chez la souris montrent que le protéome et le transcriptome de micro-vaisseaux diffèrent beaucoup en fonction de l’âge des animaux (5j, 10j et adultes). Des différences majeures concernent les isoformes de collagène et de laminine. L’ensemble de ces observations suggère que les hémorragies intracrâniennes des grands prématurés résulteraient de la conjonction d’une immaturité de la lame basale microvasculaire et d’une hyperactivité protéasique d’origine endothéliale. L’hypothèse de travail centrale des études du laboratoire est qu’une action de protection microvasculaire pourrait constituer une approche de neuroprotection de cerveau en développement dépourvue des effets secondaires pléiotropes des agents à visée de protection neurale jusqu’alors étudiés.

Objectifs généraux et spécifiques Le travail proposé vise à caractériser les différences ontogéniques d’expression protéique chez la souris, en rapport avec une vulnérabilité vasculaire néonatale spécifique. L’objectif général de la recherche proposée est de valider en culture cellulaire l’hypothèse d’un effet délétère de l’activation d’une cascade de protéases initiée par le t-PA sur l’adhésion cellulaire.
  La culture primaire de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales est très couteuse en termes de nombre d’animaux et souffre de faibles rendements. La disponibilité récente de cellules du commerce pourrait constituer une alternative à la préparation de cultures primaires. Le premier objectif est de valider sur ces cellules le maintien du phénotype immature bien caractérisé sur les cultures primaires.
  Le t-PA est très probablement un facteur important dans le re-modelage de l’environnement extracellulaire de ces cellules. Ses modes d’action sont nombreux. Nous étudierons plusieurs formes moléculaires de t-PA recombinant, native ou génétiquement modifiées pour déterminer le mécanisme d’action sur les sécrétions de protéases par les cellules endothéliales en culture (Collaboration avec les Pr D Vivien et C Ali, INSERM U-919, Cyceron, Caen)
  L’environnement extracellulaire des cellules endothéliales est semble-t’il très différent entre le nouveau-né et l’adulte chez la souris. Nous étudierons les effets des protéases sécrétées par ces cellules sur l’adhésion en culture sur des substrats mimétiques des environnements « néonatal » ou « adulte ».

Méthodologies utilisées

Culture cellulaire primaire (endotheliales et astrocytes). Biochimie des protéines (extractions, dosage, western blot, immunohistochimie, spectrométrie de masse). Le travail de caractérisation du protéome des microvaisseaux et de cultures des populations cellulaires microvasculaires en culture est entrepris en collaboration la plateforme technologique Ibisa de l’Université de Rouen (Pr P Cosette). Analyse transcriptomique (extraction d’ARN, dosage, hybridation). Le travail de caractérisation de l’expression génique dans des microvaisseaux cérébraux isolés est entrepris en collaboration avec la plateforme de génomique (Prs T Frébourg, O Vittecocq). L’analyse des données est effectuée au moyen de logiciels dédiés des plateformes (Proteom discoverer®, Progenesis®, Protein Center®, Genespring®).

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