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Etude des sécrétions de protéases par des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales en culture en fonction de la maturité cellulaire.

proposé par Dr Philippe LEROUX , Equipe INSERM-Région Haute-Normandie ERI28 Faculté de Médecine et de Pharmacie Université de Rouen

Projet de stage :

Le travail proposé vise à caractériser les différences ontogéniques d’expression et de sécrétion protéasique endothéliale vasculaire cérébrale en conditions basale ou toxique, en rapport avec une vulnérabilité néonatale spécifique.
  Les cellules endothéliales de jeune expriment un répertoire de protéines restreint par rapport à des cellules d’adulte. De plus nous observons de fortes différences de composition de la lame basale, d’expression de protéases et de leurs inhibiteurs selon l’âge dans des microvaisseaux isolés. Le premier objectif de ce projet est d’évaluer le profil de sécrétion d’un panel de protéases potentiellement impliquées dans le modelage vasculaire dans des cultures à des stades définis de maturité (cellules de 2 jours à différents passages in vitro, primocultures de 10 jours ou d’adultes. La détection sera entreprise au niveau transcriptionnel, protéique et d’activité enzymatiques).
  L’induction in vitro de marqueurs de barrière hémato-encéphalique peut être obtenue par traitement des cellules endothéliales par des milieux conditionnés par des cultures d’astrocytes. Cet artifice sera utilisé pour mimer une maturation in vitro et étudier ses conséquences sur l’expression (sécrétion) de protéases.
  Il y a une forte probabilité que les sécrétions de protéases par l’endothélium micro-vasculaire jouent un rôle dans la rupture vacsculaire à l’origine des hémorragies du grand prématuré. Les cultures cellulaires sous différentes conditions offrent un bon modèle d’étude des effets de facteurs délétères connus (ischémie, inflammation, excitotoxicité) selon l’état de différenciation. Nous mesurerons les effets de ces stimuli sur les sécrétions protéasiques dans ces cultures.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire :

Culture cellulaire primaire (endotheliales et astrocytes). Les travaux seront menés chez la souris ; en primoculture de cellules endothéliales microvasculaire cérébrales (stades tardifs) soit sur des cellules du commerce après plusieurs passages (stade très jeune).

Expression de gènes : extraction d’ARN, dosages et contrôle de qualité, Amplification et mesure par « Quantitative Multiplex Polymerase avec Sondes Fluorescentes (QMPSF) ». La QMPSF sera réalisé en collaboration avec la plateforme de génomique (Prs T Frébourg, JM Flaman).

Biochimie des protéines (extractions, dosage, western blot, immunohistochimie, ELISA)

Etudes d’acticités enzymatiques (zymographie en gel SDS-PAGE sur substrats de gélatine, caséine et/ou plasminogène ; cyto-zymographie au moyen de substrats fluorescents ; DQ-gélatine, DQ-caséine)

Documents joints

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