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Etude spatio-temporelle de la régulation de la traduction après fécondation et au cours du développement embryonnaire précoce.

proposé par Odile MULNER-LORILLON, UMR Mer&Santé CNRS/UPMC 7150, Station Biologique - BP 74, 29682 Roscoff cedex

Projet de stage : Deux familles de facteurs de traduction, des facteurs d’initiation de la famille eIF4 et des facteurs d’élongation, EF1 et EF2, ont préalablement été corrélées à la régulation de la synthèse des protéines requises lors du développement précoce (Salaun et al, 2003 ; Le Sourd et al, 2006 ; Ouhlen et al, 2007 ; Bellé et al, en preparation). Le sujet proposé pour ce stage est de participer à l’analyse de l’expression spatio-temporelle de ces facteurs dans l’embryon après la fécondation et de sa corrélation avec les modifications de la synthèse des protéines. L’étude de l’expression spatio-temporelle des transcrits codant pour les facteurs de traduction sera réalisée par une approche d’hybridation in situ. L’expression des protéines correspondantes sera parallèlement analysée par immunofluorescence grâce à des anticorps spécifiques dirigés contre la protéine ou certaines de ses modifications post-transcriptionnelles (phosphorylation, ….). La mesure de l’activité de synthèse protéique sera réalisée in situ grâce à la technique de SunSET que nous avons récemment adaptée à l’embryon d’oursin. Cette technique permet de mesurer et localiser l’activité de synthèse protéique dans des cellules ou des tissus in toto par révélation immunofluorescente de la puromycine préalablement incorporée dans les chaines peptidiques en élongation (Schmidt et al., 2009). Les analyses seront conduites dans des conditions physiologiques normales du développemnt après fécondation puis dans des conditions perturbées par des agents pharmacologiques ciblant la synthèse des protéines et/ou les voies de signalisation régulant l’activité des facteurs de traduction (voie mTOR, MAPK, CDK,…..).

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : Les techniques de biologie cellulaire (culture de gamètes et d’embryons, cinétique de développement embryonnaire, analyse d’embryons par immunofluorescence,……) et des études biochimique par Western Blot, techniques maitrisées dans le laboratoire seront utilisées. La nouvelle technique d’analyse de la synthèse protéique par marquage à la puromycine (sunset) est maintenant opérationnelle dans le laboratoite et sera largement utilisée dans ces études . La microinjection de protéines ou de mRNA dans les embryons sera également mise en œuvre, les protéines ou les messagers étant produits dans le laboratoire après clonage des gènes d’intérêt.

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