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Etudes du transcriptomique des cellules souches germinales chez le zebrafish.

proposé par Jean-Jacques LAREYRE, Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons, Campus de Beaulieu, Bâtiment 16, 35042 Rennes Cedex

Projet de stage : L’auto-renouvèlement et le recrutement des cellules spermatogoniales souches (SSCs) sont nécessaires pour le maintien de la production de spermatozoïdes chez les animaux mâles adultes. Chez les mammifères, cette population de SSCs serait en fait un pool constitué par différentes sous-populations de spermatogonies A indifférenciées retrouvée isolée As (cellule seule), ou interconnectées par des ponts cytoplasmiques (spermatogonies en doublets Apr et chaines de spermatogonies alignées Aal). Chez les poissons, les sous-populations de spermatogonies A indifférenciées restent mal caractérisées au niveau moléculaire et fonctionnelle. Notre équipe a récemment isolée par FACS (Fluorescence Assisted Cell Sorting) une fraction de spermatogonies de type A organisées en paires à partir d’une lignée transgénique de poissons zèbre exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) dans ces cellules. Des expériences préliminaires de transplantation ont montré que ces cellules étaient capables de coloniser les gonades d’un animal receveur, une propriété reconnue des cellules souches germinales. L’objectif du stage proposé est de participer à l’identification de récepteurs membranaires exprimés dans les SSCs du poisson zèbre et potentiellement impliquées dans des voies de régulation paracrines contrôlant le devenir des cellules souches qui peuvent rester quiescente, s’auto-renouveler, ou se différencier. Le transcriptome des spermatogonies Apr fluorescentes sera généré par la technique de séquençage à très haut débit (RNA seq d’Illumina) et analysé au moyen de différents filtres pour identifier des transcrits codant pour des récepteurs membranaires candidats. L’expression des différents transcrits candidats dans les spermatogonies Apr sera vérifiée par la technique d’hybridation d’ARN in toto sur gonades entières mais aussi par qPCR à partir de différentes populations de cellules germinales et somatiques isolées de différentes lignées transgéniques de poissons zèbre disponibles au laboratoire (Gautier et al., 2011, Gautier et al., 2013).

Techniques mises en œuvre par le stagiaire :
  Purification de différentes populations de cellules germinales et somatiques par FACS (fluorescence Assisted Cell Sorting).
  L’expression des gènes sera analysée par PCR quantitative en temps réel après extraction de l’ARN total des cellules ou des tissus gonadiques.
  Clonage d’ADNc partiels et production de ribosondes pour l’hybridation in toto d’ARNm sur des gonades entières (révélation chromogénique et/ou fluorescence).
  Histologie
  Microscopie confocale et photonique.
  Bioinformatique : analyse de séquences nucléiques, analyse de la structure des gènes sur genomebrower, design d’amorces pour qPCR, analyse de génomes pour l’identification d’orthologues et de paralogues chez les autres vertébrés.

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