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Interaction gamétique et fusion membranaire

proposé par BrigitteLefèvre, INSERM, Université Paris-Descartes, Paris

Projet de stage : Les protéines ancrées à un glycosyl-phosphatidylinositol (GPI-APs), protéines membranaires impliquées dans l’organisation et l’induction de voies de signalisation, sont impliquées dans la fusion gamétique. En effet, l’invalidation conditionnelle au niveau de l’ovocyte du gène Pig-a, (codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse du GPI), entraîne la disparition de toutes les GPI-APs à la surface de l’ovocyte et la perte de la capacité fusiogène de la membrane ovocytaire. La GPI-AP impliquée dans la fusion gamétique n’est pas encore identifiée. La délétion de Gas-1 est généralement létale, mais les rares femelles mutantes qui survivent sont très hypofertiles. Nous avons donc vérifié par Western blot la présence de cette GPI-AP dans l’ovocyte en métaphase II (MII), stade auquel l’ovocyte est ovulé et prêt à être fécondé. Grâce à la microscopie confocale, nous avons observé que Gas-1 est localisée sur la membrane de l’ovocyte, et sommes entrain de vérifier les modifications de cette localisation au cours de la méiose et de la fécondation. Lors de fécondation in vitro, nous avons pu observer une diminution significative des index de fécondation lorsque les ovocytes dépéllucidés étaient mis en présence des spermatozoïdes dans un milieu supplémenté en anticorps anti-Gas1. Nous voulons maintenant vérifier les effets de la microinjection de Gas-1 siRNA sur la capacité de fusionner des ovocytes. Puis nous réaliserons des souris KO conditionnelles en croisant des souris Gas1 floxées (données prochainement par l’équipe américaine du Dr Fan - Baltimore) et de souris ZP3-Cre (du laboratoire) pour vérifier si les femelles sont stériles ou pas. Ces travaux permettront de confirmer si cette GPI-AP, Gas-1 est ou pas impliquée dans la fusion gamétique. Si elle l’est, nous chercherons alors à analyser son rôle en analysant ses liens avec la tétraspanine CD9 et les intégrines αvβ3 et α6β1 à la fois dans l’organisation membranaire et l’induction de voies de signalisation.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : Super ovulation des souris, préparation des gamètes mâles et femelles de souris, microinjection des ARN interférents au stade VG, maturation in vitro des ovocytes, vérification de l’inhibition par RT-PCR, Western Blot et Immunofluorescence observée en microscopie confocale. Fécondation in vitro et immunocytochimie

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