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Mécanisme d’action de Spaca6 dans l’adhésion/fusion des gamètes

proposé par Ahmed ZIYYAT, Institut Cochin Inserm U-1016 24 Génomique Epigénétique et Physiopathologie de la Reproduction 24, rue du Fbg Saint Jacques, 75014 Paris France

Projet de stage : La fusion cellulaire joue un rôle clef dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Celle d’un spermatozoïde et d’un ovocyte marque le début de la vie, mais peu de gènes sont connus pour leur implication indispensable à l’interaction gamétique au moment de la fécondation. Il s’agit des gènes Cd9 et Juno ovocytaires et du gène Izumo1 spermatique (Le Naour et al., 2000 ; Inoue et al., 2005 ; Bianchi et al., 2014). En utilisant le système CRISPR/Cas9, nous avons généré une souris invalidée pour Spaca6, un autre gène spermatique qui comme Izumo1 code une immunoglobuline-like. Les mâles sont complètement stériles à cause d’un défaut de fusion et une accumulation des spermatozoïdes dans l’espace périvitellin, phénotype identique à celui retrouvé chez les souris invalidées pour les trois gènes cités ci-dessus. Des expériences d’ICSI (IntraCytoplasmic Sperm Injection) seront réalisées afin de vérifier que les spermatozoïdes invalidés permettent un développement normal. Une transgénèse additive en injectant une construction possédant un promoteur spermatique (ACE), Spaca6 et un tag (mCherry) devrait permettre d’une part de restaurer la fertilité des mâles et d’autre part de suivre la dynamique de Spaca6-mCherry (microscopie confocale) durant la réaction acrosomique et l’adhésion/fusion avec l’ovocyte. La relocalisation d’Izumo1 étant nécessaire à la fécondation (Sosnik et al., 2009), nous l’étudierons en absence de Spaca6. Une colocalisation et une interaction entre Spaca6 et Izumo1 (et d’autres acteurs moléculaires spermatiques) seront recherchées sur les spermatozoïdes chez la souris et l’homme. Nous sommes actuellement en train de produire des anticorps monoclonaux dirigés contre Spaca6 qui seront testés en fécondation in vitro, en immunomarquage et éventuellement utilisés en co-immunoprécipitation.

Références Bianchi E, Doe B, Goulding D, Wright GJ. 2014. Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization. Nature. Inoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe M. 2005. The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs. Nature 434:234-238. Le Naour F, Rubinstein E, Jasmin C, Prenant M, Boucheix C. 2000. Severely reduced female fertility in CD9-deficient mice. Science 287:319-321. Sosnik J, Miranda PV, Spiridonov NA, Yoon SY, Fissore RA, Johnson GR, Visconti PE. 2009. Tssk6 is required for Izumo relocalization and gamete fusion in the mouse. J Cell Sci 122:2741-2749.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : PCR, RT-PCR, Western blot, Co-immunoprécipitation, Croisement de souris, Fécondation in vitro, ICSI, Histologie, Immunofluorescence, Microscopie confocale, Culture et Transfection cellulaires.

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