Mécanisme moléculaire d’action de la tétraspanine CD9 dans l’interaction gamétique.

Projet de stage : La technique de Biomembrane Force Probe (BFP) a permis, en collaboration avec Christine Gourier de l’ENS Paris, de mettre en contact in vitro les deux gamètes et de mesurer la force de rupture des liens établis entre leurs molécules membranaires. En comparant les forces de rupture développées lors de la séparation d’un spermatozoïde lié soit à un ovocyte sauvage soit à un ovocyte n’exprimant pas la tétraspanine CD9, nous avons décrit deux types de forces en présence de CD9 dont un disparaît lorsque CD9 est absente. Celui qui dépend de CD9 est le seul capable de conduire à la fusion. Il correspond à des interactions où un lien s’établi entre le spermatozoïde et la membranaire ovocytaire d’une part et un autre lien plus fort s’établi entre la membrane et le cytosquelette ovocytaires de l’autre. Ce lien se fait vraisemblablement via des partenaires directs de CD9 tels que EWI-2 et EWI-F, présents à la fois sur des cellules somatiques et sur les ovocytes. Par ailleurs, ces partenaires de CD9 se lient directement aux molécules ezrin-radixin-moesin (ERM) qui connectent le cytosquelette d’actine à la membrane plasmique. Notre projet consiste à inhiber l’expression d’EWI et d’ERM par ARN interférence dans l’ovocyte ce qui devrait se traduire par la perte du lien entre CD9 et le cytosquelette et par conséquent par la disparition des adhésions fortes. Les conséquences de cette perte seront évaluées en fécondation in vitro puis en mesure de force.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : Super ovulation des souris, préparation des gamètes mâles et femelles de souris, microinjection des ARN interférents au stade VG, maturation in vitro des ovocytes, vérification de l’inhibition par RT-PCR, Western Blot et Immunofluorescence. Fécondation in vitro et mesures des nanoforces par micromanipulation. Participation à l’analyse statistique et l’interprétation des courbes obtenues.