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Modèle mûrin de congélation du tissu testiculaire immature : effet de la congélation sur la capacité des cellules germinales à se différencier in vitro ou après xénogreffe

proposé par Nathalie RIVES, Laboratoire de Biologie de la Reproduction, CHU Charles Nicolle, 1 rue de Germont, 76031 Rouen

Projet de stage : Chez le jeune garçon pré pubère, comme cela est proposé chez la petite fille, la conservation du tissu gonadique doit être envisagée dans les situations à risque très élevé de stérilité par altération définitive de l’épithélium séminifère. En effet, une inégalité de chance de préservation de la fertilité existe, à l’heure actuelle, entre le garçon et la petite fille soumis à des thérapeutiques anticancéreuses gonadotoxiques. Les données actuelles de la littérature sur les milieux de congélation (cryoprotecteur pénétrant ou non pénétrant) et les protocoles de congélation du tissu testiculaire immature restent fragmentaires et ne permettent pas pour l’instant de proposer de manière certaine une procédure de congélation qui garantirait au mieux la viabilité des cellules testiculaires (germinales et somatiques) après décongélation. La congélation du tissu testiculaire pré pubère intéresse des cellules riches en cytoplasme donc plus vulnérables à la congélation, principalement les cellules germinales (les spermatogonies) mais aussi les cellules somatiques (cellules de Sertoli et de Leydig). En effet, la congélation et la conservation du tissu immature doivent maintenir (i) la viabilité des spermatogonies souches et somatiques, (ii) les interrelations existant entre cellules germinales et cellules somatiques, (iii) la capacité des spermatogonies souches à initier et maintenir une spermatogenèse, (iv) le rôle de soutien et régulateur des cellules de Sertoli, enfin (v) la fonction endocrine des cellules de Leydig. L’intégrité de l’ensemble du tissu testiculaire doit être préservée et la vérification de cette intégrité passe par une vérification de sa fonctionnalité par culture in vitro (spermatogenèse et stéroïdogenèse) et xénogreffe tissulaire.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : Les animaux utilisés sont des souris mâles de la souche CD1 âgées de 6 à 7 jours. Les femelles gestantes sont obtenues à 15 jours post-coïtum et sont élevées en animalerie. Chaque souriceau sera sacrifié par décapitation avant le prélèvement des testicules.

a. Milieu de congélation et protocole de congélation

Les milieux de congélation utilisés compareront trois cryoprotecteurs pénétrants différents [Diméthylsulfoxyde (DMSO), 1,2-propanediol (PROH) et Ethylène Glycol] isolés ou associés à un cryoprotecteur non pénétrant (sucrose). Nous comparerons deux courbes de descente en température contrôlées lentes avec ou sans seeding.

b. Morphologie tissulaire et cellulaire

La morphologie tissulaire sera analysée sur des coupes histologiques provenant de testicules décongelés inclus en paraffine et colorés à l’hématoxyline-éosine. Les modifications de l’architecture des tubes séminifères et un comptage du nombre de cellules germinales, de cellules de Sertoli et de cellules de Leydig présentes dans les tubes avant et après décongélation selon les différents protocoles seront évalués (annexe). Une identification des cellules exprimant l’antigène PCNA donc possédant les capacités de proliférer complètera cette évaluation morphologique.

c. Evaluation de la viabilité cellulaire et de la mort cellulaire

La viabilité cellulaire et la mort cellulaire par apoptose seront appréciées après digestion enzymatique des fragments testiculaires avant et après chacune des étapes du protocole de congélation et décongélation (i) immédiatement après la digestion enzymatique et (ii) après une culture de 24 heures dans une étuve à 33°C, 5% de CO2. La viabilité cellulaire sera déterminée par la coloration vitale au bleu de trypan. L’apoptose sera appréciée par l’externalisation des phosphatidyl-sérines membranaires mesurées par l’annexine V et la détection de la fragmentation de l’ADN par la méthode TUNEL, déterminées avant et immédiatement après chacune des étapes de congélation - décongélation, mais aussi après une culture de 24 heures des cellules testiculaires en suspension.

d. Culture de tubes séminifères entiers et test fonctionnels

La culture des tubes séminifères sera effectué pour le DMSO et le PROH pour les conditions décrites ci-dessus et également pour l’Ethylène Glycol si cette nouvelle condition préserve de manière aussi efficace que les précédentes l’architecture des tubes séminifères. Chaque testicule décongelé est découpé en 4 à 8 fragments en fonction de sa taille initiale et mis en culture dans du milieu IVF (Médicult®, France) supplémenté en FSH recombinante (Organon ou Sérono, France) et en hCG (Organon ou Sérono, France) dans une étuve à 33°C et 5% CO2 pendant 15 jours. Le milieu de culture est prélevé tous les 48 heures et congelé. La concentration en testostérone produite dans le milieu sera mesurée en radio-immunoanalyse. La culture est arrêtée au bout de 15 jours et les fragments testiculaires sont inclus en paraffine avant coloration et marquage au PCNA afin d’évaluer l’aspect général du tissu et de chacun des tubes séminifères. Une quantification des cellules de Sertoli et des cellules germinales est réalisée avant et après culture.

e. Xénogreffe chez la souris "nude"

Pour les meilleures conditions de congélation, trois fragments tissulaires seront greffés chez la souris "nude castrée" du même âge (trois essais de greffes). Une évaluation de la présence d’une spermatogenèse active sera effectuée à 3 mois et à 6 mois sur les greffons prélevés avec quantification des cellules germinales présentes.

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