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Modèles "rongeurs" (souris et rat) de congélation du tissu testiculaire immature : effet de la congélation sur la capacité des cellules germinales à se différencier in vitro ou après xénogreffe

proposé par Nathalie Rives, EA 4308 "Spermatogenèse et qualité du gamète mâle", Laboratoire de Biologie de la Reproduction – CECOS, CHU – Hôpitaux de Rouen – CHU Charles Nicolle, 1 rue de Germont, 76031 Rouen

Projet de stage :

Chez le jeune garçon pré pubère, comme cela est proposée chez la petite fille, la conservation du tissu gonadique doit être envisagée dans les situations à risque très élevé de stérilité par altération définitive de l’épithélium séminifère. En effet, une inégalité de chance de préservation de la fertilité existe, à l’heure actuelle, entre le garçon et la petite fille soumis à des thérapeutiques anticancéreuses gonadotoxiques.

Les données actuelles de la littérature sur les milieux de congélation (cryoprotecteur pénétrant ou non pénétrant) et les protocoles de congélation du tissu testiculaire immature restent fragmentaires et ne permettent pas pour l’instant de proposer de manière certaine une procédure de congélation qui garantirait au mieux la viabilité des cellules testiculaires (germinales et somatiques) après décongélation. La congélation du tissu testiculaire pré pubère intéresse des cellules riches en cytoplasme donc plus vulnérables à la congélation, principalement les cellules germinales (les spermatogonies) mais aussi les cellules somatiques (cellules de Sertoli et de Leydig). En effet, la congélation et la conservation du tissu immature doivent maintenir (i) la viabilité des spermatogonies souches et somatiques, (ii) les interrelations existant entre cellules germinales et cellules somatiques, (iii) la capacité des spermatogonies souches à initier et maintenir une spermatogenèse, (iv) le rôle de soutien et régulateur des cellules de Sertoli, enfin (v) la fonction endocrine des cellules de Leydig. L’intégrité de l’ensemble du tissu testiculaire doit être préservée et la vérification de cette intégrité passe par une vérification de sa fonctionnalité par culture in vitro (spermatogenèse et stéroïdogenèse) et xénogreffe tissulaire.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire :

Expérimentation animale : modèle souris et rat

a. Congélation tissulaire

b. Morphologie tissulaire et cellulaire Sur coupes histologiques provenant de testicules décongelés inclus en paraffine et colorés à l’hématoxyline-éosine. Identification et quantification des cellules exprimant l’antigène PCNA.

c. Evaluation de la viabilité cellulaire et de la mort cellulaire Après digestion enzymatique des fragments testiculaires avant et après chacune des étapes du protocole de congélation et décongélation (externalisation des phosphatidyl-sérines membranaires mesurées par l’annexine V et détection de la fragmentation de l’ADN par la méthode TUNEL).

d. Culture de tubes séminifères entiers et test fonctionnels Culture de tubes séminifères de 15 jours : prélèvement du milieu tous les 48 heures, évaluation de la concentration en testostérone produite dans le milieu par radio-immunoanalyse, morphomètrie tissulaire, caractèrisation et quantification des cellules germinales et somatiques présentes après inclusion des fragments testiculaires en paraffine, expression et quantification du PCNA.

e. Xénogreffe chez la souris "nude" et autre souris immunodéficiente non encore rapportée dans la littérature Prélèvement des greffons au bout de 3, 6 et 12 mois : morphométrie, quantification, évaluation de la présence ou non d’une spermatogenèse active

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