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Modulation des voies de signalisation par des microARN dans un modèle d’atteinte inflammatoire de la substance blanche du souriceau mimant les lésions cérébrales du nouveau-né prématuré

proposé par Pierre Gressens, Inserm U676, Hôpital Robert Debré, Paris

CONTEXTE L’inflammation périnatale est responsable d’un syndrome inflammatoire chez le fœtus ou le nouveau-né, qui peut conduire à des atteintes de la substance blanche cérébrale notamment chez le prématuré (1). Au cours des dernières années, l’imagerie cérébrale a montré un changement des atteintes cérébrales du prématuré, avec une quasi disparition des atteintes de type clastique (leucomalacie kystique) et une appariation d’atteintes plus diffuses de la substance blanche qui correspondent davantage à un arrêt de la maturation oligodendrocytaire, sans perte cellulaire, accompagnée d’une réaction microgliale (2, 3). En effet, la formation de myéline est, au niveau du système nerveux central, assurée par les oligodendrocytes, dont la maturation est essentielle à l’accomplissement de leur fonction (7). D’autre part, la microglie (macrophage du cerveau) joue un rôle complexe en participant à l’inflammation (phénotype M1) mais également à la réparation des lésions cérébrales et à la transmission du signal nerveux (phénotype M2) (4,5,6). Récemment, plusieurs études ont permis de démontrer l’implication des microARN (miARN) dans l’activation microgliale et la maturation des oligodendrocytes (8,9). Ces petits ARN non codants d’une vingtaine de nucléotides peuvent modifier la traduction des ARN messagers (ARNm). Afin de modéliser le type d’atteinte cérébrale observé chez les prématurés du 21ème siècle, l’UMR 676 a récemment développé un modèle murin reposant sur l’injection systémique d’IL-1beta, mimant le syndrome inflammatoire, en période néonatale (10). Cette inflammation est responsable d’une activation microgliale ainsi que d’un arrêt de maturation des précurseurs des oligodendrocytes, induisant de ce fait un défaut de myélinisation. Ce modèle offre donc la possibilité d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents et d’identifier de nouvelles cibles potentielles de neuroprotection. Dans ce modèle murin, les oligodendrocytes et les cellules de la microglie ont été isolés après le traitement. Les ARNm et les miARN ont été analysés par microarray afin de comparer leur expression chez les animaux témoins (traités au PBS) et ceux traités à l’IL-1beta. Les résultats ont mis en évidence des modifications d’expression d’ARNm impliqués dans différentes voies de signalisation et de grandes fonctions cellulaires ainsi que de plusieurs miARN. Les relations entre miARN et réseaux d’ARNm sont en cours d’analyse bioinformatique. Cette approche devrait déboucher sur l’identification d’un petit nombre de miARN impliqués dans l’activation microgliale et/ou le blocage de la différentiation oligodendrocytaire suite à l’exposition à l’IL-1beta.

OBJECTIFS L’objectif du travail sera de valider certaines données issues de cette analyse bioinformatique et de définir l’implication d’un ou plusieurs miARN dans l’activation microgliale et/ou le blocage oligodendrocytaire induits par l’inflammation périnatale.

METHODES
  Modèle animal, tri cellulaire et validation des candidats issus de l’analyse bioinformatique. Les souriceaux reçoivent 10 µg/kg/injection d’IL-1beta ou PBS par injection intrapéritonéale du jour post-natal (P) 1 à P5. A P5 ou à P10, les mâles sont sacrifiés et les cerveaux sont prélevés. Les oligodendrocytes et de la microglie sont purifiés en utilisant respectivement des anticorps anti-O4 et anti-CD11B couplés à des billes magnétiques. L’expression des ARN (ARNm et miARN) d’intérêt sera étudiée dans ces cellules par RT-PCR quantitative (q-RT-PCR).
  Cultures primaires d’oligodendrocytes et de microglie Les souriceaux sont sacrifiés à P1, leurs cerveaux sont prélevés et les cellules sont dissociées. Les cellules gliales (astrocytes, microglie et oligodendrocytes) sont mises en culture pendant 9 à 12 jours. Ces cultures primaires pourront être exposées à l’IL-1beta ou à d’autres substances afin d’agir sur l’activation microgliale et la différenciation oligodendrocytaire in vitro.
  Implication des miARN validés dans l’activation microgliale et/ou le blocage oligodendrocytaire. L’expression de certains miARN identifiés dans l’analyse bioinformatique et validés dans la première étape du travail sera modifiée in vitro dans les cultures primaires d’oligodendrocytes ou de microglie. Pour cela, les cellules seront transfectées avec un ARN synthétique mimant l’effet d’un miARN d’intérêt, ou, au contraire, exerçant sur lui un effet inhibiteur. L’analyse se fera à deux niveaux, par q-RT-PCR : 1) étude de l’expression de gènes clés impliqués dans certaines voies de signalisation modulés par l’IL-1beta ; 2) étude de l’expression de marqueurs d’activation microgliale et de différenciation oligodendrocytaire.

RESULTATS, PERSPECTIVES Certains miARN régulant des réseaux de signalisation sont responsables des effets de l’inflammation systémique sur l’activation microgliale et le blocage oligodendrocytaire en période périnatale. Notre travail devrait contribuer à valider cette hypothèse et identifier, in vitro, un petit nombre de miARN qui, s’ils étaient confirmés in vivo, pourraient représenter des cibles thérapeutiques originales pour protéger le cerveau du prématuré.

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