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Oscillation calciques declanché par les spermatozoïdes.

proposé par Alexander McDOUGALL, UMR7009, Station Zoologique, 06230 Villefranche-sur-Mer

Projet de stage : Nous avons terminé le séquençage du génome de P. mammillata et allons maintenant procéder à l’identification par protéomique des protéines présentes dans notre extrait semi-purifié de sperme. L’analyse par gel indique qu’il ya moins de 50 protéines majeures après les 4 étapes de purification (3 HPLC et une étape de fractionnement). L’objet du stage sera de cloner les candidats les plus probables venant de l’analyse protéomique et de préparer des ARNm synthétiques codant pour ces protéines. Nous allons ensuite microinjecter les ARNm pour produire la protéine correspondante dans l’œuf non fécondé afin d’identifier la protéine qui déclenche l’activation d’oeuf dans l’ascidie (l’invertébré marin le plus proche des vertébrés). Nous allons ensuite suivre les oscillations de calcium par microscopie de fluorescence en time-lapse, afin de vérifier que la protéine isolée imite le spermatozoide. L’approche expérimentale impliquera des techniques d’électrophorèse sur gel des protéines, biologie moléculaire (clonage Gateway, synthèse de l’ARNm), microinjection, microscopie par fluorescence et d’imagerie du calcium intracellulaire (epifluorescence et confocale).

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : Biochimie des protéines - électrophorèse sur gel, biologie moléculaire - le clonage, synthèse de l’ARNm, la fécondation in vitro, culture d’embryons, microinjection, fluorescence time-lapse imagerie de la concentration de calcium

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