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Protéines ovocytaires associées à un GPI et fécondation

proposé par Brigitte LEFEVRE, EA 2717, Fusion Membranaire et Interaction Gamétique, IFR Alfred Jost, Faculté de Médecine Paris Descartes, site Cochin, 24 rue du Fbg Saint Jacques, 75014 PARIS

Projet de stage : Deux familles de protéines membranaires apparaissent indispensables à l’adhésion puis la fusion des gamètes, ainsi que les voies de signalisation associées, lors de la fécondation : les tétraspanines et les protéines ancrées à un glycosyl-phosphatidylinositol (GPI-APs). En effet, les souris femelles déficientes en tétraspanine CD9 ou en GPI-APs ont une fertilité très réduite. Cependant, on ne connaît pas encore la GPI-AP de la membrane ovocytaire impliquée dans la fécondation. Notre objectif est donc de la ou les rechercher, puis de trouver, comme cela a été montré dans d’autres types cellulaires, les liens entre elle(s) et les tétraspanines présentes sur la membrane ovocytaire. Nous rechercherons ensuite avec quelles intégrines ce regroupement de GPI-AP(s) et de tétraspanines s’associe, et quelles voies de signalisation sont alors mises en fonction, en nous intéressant plus particulièrement à trois enzymes PKC, PI3-Kinase et PI4-Kinase, toutes dépendantes du calcium.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire : Le stagiaire s’occupera de la préparation des gamètes mâles et femelles de souris qu’il utilisera pour les différentes expériences, ainsi que pour les FIV. Afin de vérifier le rôle des différentes GPI-APs dans la fusion membranaire des gamètes, il utilisera :
- différents anticorps [CD52 ; CD48 ; CD157 (BST-1/CD38-like, RF3) ; CD16 (anti-leu-11a, NKP15) ; CD14 (Thy-1, 5E10)
- la PI-Phospholipase C pour libérer les GPI-APs de la surface des ovocytes.
- le GFP-GPI permettra de contrôler les mouvements membranaires de cette protéine. Le rôle des enzymes sera analysé en utilisant, entre autres, des inhibiteurs [inhibiteurs de PI3K : LY294002 et wortmannin et inhibiteur de PKC : CHE chlerythrine chloride]. Les regroupements membranaires seront perturbés en séquestrant le cholestérol en traitant les ovocytes au MβCD (methyl-β-cyclodextrine), drogue qui extrait le cholestérol de la membrane en l’incluant dans une cavité centrale, ou encore en empêchant les interactions tétraspanines –tétraspanines en chélatant les cations bivalents par EDTA.

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