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Rôle de Spaca6 dans l’adhésion des gamètes chez la souris et l’homme.

proposé par Ahmed ZIYYAT , Institut Cochin Inserm U-1016 Génomique, Epigénétique et Physiopathologie de la Reproduction 75014 Paris

Projet de stage : Parmi les acteurs moléculaires membranaires impliqués dans l’adhésion/fusion des gamètes chez les mammifères, seuls trois, l’immunoglobuline spermatique Izumo1 (Inoue et al., 2005), son récepteur ovocytaire récemment caractérisé Juno (Bianchi et al., 2014) et la tétraspanine Cd9 ovocytaire se sont révélées essentielles (Kaji et al., 2000 ; Le Naour et al., 2000 ; Miyado et al., 2000). Les trois sont également présents sur les gamètes humains et jouent un rôle important au cours de la fécondation (Inoue et al., 2013 ; Inoue et al., 2005 ; Ziyyat et al., 2006). Des travaux récents indiquent qu’Izumo1 est une protéine d’adhésion (Bianchi et al., 2014 ; Inoue et al., 2013) et que Cd9 organise les complexes moléculaires nécessaires à l’adhésion (Jegou et al., 2011). Après l’invalidation d’un des ces gènes chez la souris, il n’y a quasiment plus de fusion, mais une adhésion entre les gamètes persiste. Ceci suggère l’existence d’autres acteurs moléculaires participant à l’adhésion. Un travail récent a montré que les souris mâles dont une portion chromosomique contenant le gène Spaca6 a été délétée étaient complètement stériles. Le phénotype retrouvé est similaire à celui causé par la délétion d’Izumo1, Cd9 ou Juno, à savoir la présence des spermatozoïdes dans l’espace périvitellin (Lorenzetti et al., 2014). Au cours de ce projet, nous proposons de confirmer la présence de Spaca6 sur le spermatozoïde humain, puis de produire une protéine recombinante (GFP) contenant le domaine extracellulaire de Spaca6 qui est aussi une immunoglobuline-like. Après transfection de cellules normalement incapables d’adhérer à l’ovocyte, la capacité de Spaca6 de lier son récepteur sera testée sur des ovocytes humains et de souris. Un peptide extracellulaire servira à l’immunisation et la production d’un anticorps qui sera utilisé pour des tests d’inhibitions en fécondation in vitro. Une colocalisation et une interaction entre Spaca6 et Izumo1 seront recherchées Références Bianchi, E., B. Doe, D. Goulding, and G.J. Wright. 2014. Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization. Nature. Inoue, N., D. Hamada, H. Kamikubo, K. Hirata, M. Kataoka, M. Yamamoto, M. Ikawa, M. Okabe, and Y. Hagihara. 2013. Molecular dissection of IZUMO1, a sperm protein essential for sperm-egg fusion. Development. 140:3221-3229. Inoue, N., M. Ikawa, A. Isotani, and M. Okabe. 2005. The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs. Nature. 434:234-238. Jegou, A., A. Ziyyat, V. Barraud-Lange, E. Perez, J.P. Wolf, F. Pincet, and C. Gourier. 2011. CD9 tetraspanin generates fusion competent sites on the egg membrane for mammalian fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 108:10946-10951. Kaji, K., S. Oda, T. Shikano, T. Ohnuki, Y. Uematsu, J. Sakagami, N. Tada, S. Miyazaki, and A. Kudo. 2000. The gamete fusion process is defective in eggs of Cd9-deficient mice. Nat Genet. 24:279-282. Le Naour, F., E. Rubinstein, C. Jasmin, M. Prenant, and C. Boucheix. 2000. Severely reduced female fertility in CD9-deficient mice. Science. 287:319-321. Lorenzetti, D., C. Poirier, M. Zhao, P.A. Overbeek, W. Harrison, and C.E. Bishop. 2014. A transgenic insertion on mouse chromosome 17 inactivates a novel immunoglobulin superfamily gene potentially involved in sperm-egg fusion. Mamm Genome. 25:141-148. Miyado, K., G. Yamada, S. Yamada, H. Hasuwa, Y. Nakamura, F. Ryu, K. Suzuki, K. Kosai, K. Inoue, A. Ogura, M. Okabe, and E. Mekada. 2000. Requirement of CD9 on the egg plasma membrane for fertilization. Science. 287:321-324. Ziyyat, A., E. Rubinstein, F. Monier-Gavelle, V. Barraud, O. Kulski, M. Prenant, C. Boucheix, M. Bomsel, and J.P. Wolf. 2006. CD9 controls the formation of clusters that contain tetraspanins and the integrin alpha 6 beta 1, which are involved in human and mouse gamete fusion. J Cell Sci. 119:416-424.

Techniques mises en œuvre par le stagiaire :

RT-PCR, Séquençage, Transfection, Dual pipette, Co-immunoprécipitation, Microscopie confocale, Fécondation in vitro.

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